Adão Jr. Viana de Paula [1]

Greicielly Barbosa Santos [2]

Daniela Veiga Costa [3]

Lívia das Graças Amaral Avelar [4]

Antônio Augusto Fonseca Jr. [5]

 

RESUMO: A técnica de DNA barcoding é uma importante ferramenta que auxilia a identificação de gêneros e espécies em nível molecular, baseada em genes ribossomais e mitocondriais. A metodologia pode ser importante na análise de peixes comercializados que podem apresentar classificação morfológica incorreta ou ocorrer substituição por fraude. O presente trabalho teve como objetivo analisar e verificar a correta identificação de peixes vendidos no comércio de Belo Horizonte. Os peixes foram adquiridos em mercado popular de Belo Horizonte e devidamente identificados de acordo com o comerciante. Foi realizada a extração de DNA de cada amostra e utilizou-se o método de PCR para a amplificação do gene da subunidade I da enzima citocromo c oxidase (COI), localizado no DNA mitocondrial. Este gene tem várias vantagens, como os iniciadores universais que são fortes, restauráveis, ou seja, são bem estabelecidos em múltiplos filos de animais e também apresenta uma vasta variação de sinal filogenético. O sequenciamento de cada amostra foi realizado pelo método de Sanger, alinhado e analisado junto ao programa de bioinformática BLAST, comparando sequências depositadas nos bancos de dados GenBank e BOLD (Barcode of Life Data Systems). Foram realizadas análises filogenéticas, o que possibilitou a determinação do gênero e espécie das amostras em análise. A metodologia foi eficaz, apresentando algumas adaptações. Ao final dos resultados, não houve a detecção da substituição do peixe vendido no mercado de Belo horizonte, sendo assim, não houve fraude.

 

PALAVRAS-CHAVE: Peixes. DNA barcoding. Identificação incorreta.

 

ABSTRACT: The DNA barcoding technique is an important tool that helps the identification of gender and species at the molecular level, based on ribosomal and mitochondrial genes. The method might be useful in the analysis of commercialized fish that may present incorrect morphological classification or even substitution for fraud. The present work sought to analyze and verify the correct identification of fish sold in the markets of Belo Horizonte city. The fish were purchased in popular market of Belo Horizonte and properly identified according to the seller. DNA extraction from each sample was performed and the PCR method was used for the amplification of the cytochrome c oxidase subunit I gene (COI) located in the mitochondrial DNA. This gene has several advantages, such as universal primers that are strong, restorable, well established in multiple phyla of animals and also exhibits a wide variation of phylogenetic signal. The sequencing of each sample was performed by the Sanger method, aligned and analyzed with the BLAST bioinformatics program, comparing sequences deposited in the GenBank and BOLD (Barcode of Life Data Systems) databases. Phylogenetic analyzes were performed, which allowed the determination of the gender and species of the samples under analysis. The method was effective, with some adaptations. The results detected no replacement of the fish sold in the market of Belo Horizonte, thus, it was concluded that there was no fraud.

 

KEYWORDS: Fish. DNA barcoding. Incorrect identification.

 

Introdução

A venda de pescado faz parte do grupo de atividades importantes para a alimentação no Brasil. Apesar de o país ser conhecido pela pecuária, a pesca é suficientemente relevante para ter seu próprio ministério criado com a intenção de desenvolver ainda mais a produção do país. O processo, desde a captura dos peixes até a aquisição por parte do consumidor, é longo e com possibilidade de interferência de muitos intermediários. Durante essas etapas, existe o risco de substituição de espécies se não ocorrer a devida fiscalização.

A substituição das espécies de peixes comercializadas pode ocorrer por fraude ou simplesmente por erro de identificação do espécime, o que pode impactar em diversas áreas desde a venda incorreta e por preços divergentes para o consumidor até a ameaça a espécies já ameaçadas (Rasmussen e Morrisey, 2008). Agências regulatórias foram criadas nos Estados Unidos e Europa para estabelecer marcos regulatórios para a pesca e a correta identificação (Martinez et al., 2005).

Os cardumes estão diminuindo dramaticamente, a despeito de esforços para a produção em cativeiro, e parte do motivo é a pesca predatória visando ao comércio nacional ou internacional (Pauly et al., 2002). A comercialização de espécies ameaçadas é, portanto, outro problema importante na indústria pesqueira.

Os métodos moleculares são uma tecnologia eficiente para a correta identificação de espécies animais. Técnicas como cromatografia líquida de alta eficiência, focalização isoelétrica e eletroforese em gel de poliacrilamida já foram utilizadas para tal fim (Rasmussen et al., 2008), no entanto a utilização do DNA tem vantagens como estabilidade da molécula alvo, uso em diferentes estágios da vida do animal (ovos, larvas e adultos) ou em produtos já processados como filés (Carvalho et al., 2011).

A identificação molecular pela técnica de DNA barcoding é uma importante ferramenta de apoio à sistemática. Hebert et al. (2003) propuseram, então, uma única sequência genética capaz de diferenciar em sua totalidade ou a maioria das espécies animais. Essa técnica baseia-se na sequência do gene COI, este localizado no DNA mitocondrial. A sequência genética foi então comparada ao sistema de código de barras. A identificação por barcode utilizando a sequência do COI é capaz de fornecer a distribuição da divergência genética das espécies (Pereira et al., 2013).

A técnica molecular de análise de DNA mitocondrial (mtDNA) já foi utilizada no Brasil para identificação de surubim vendido em Belo Horizonte (Pseudoplatystoma corruscan e Pseudoplastystoma reticulatum) (Carvalho et al., 2011). Os resultados indicaram que a identificação incorreta do pescado ocorre em baixos índices quando o próprio peixe é vendido, no entanto, até 58% dos filés comercializados estavam incorretamente identificados.

 

Metodologia

A metodologia se baseia no uso da técnica de PCR para amplificar o gene da subunidade I da enzima citocromo c oxidase (COI) seguida de sequenciamento de comparação com sequências de referência (Espineira et al., 2008). As análises das sequências, obtidas ao fim dos testes in vitro, são realizadas por bioinformática com inserção dos dados em programas que os compararão com bancos de dados. Dentre as fontes de referência estão o GenBank, banco de dados público e voltado para diversos fins mantido pelo governo dos Estados Unidos, e o Barcode of Life Data Systems (BOLD), produto de um esforço global para sequenciar o COI de diversas espécies para criar uma ferramenta de referência para estudos de identificação (Ward et al., 2009).

As amostras foram adquiridas no mercado popular de Belo Horizonte (Tabela 1). Foram comprados filés de Surubim (Pseudoplastystoma sp.), Tilápia (Oreochromis sp.), Salmão (Salmo salar), Merluza (Merluccius sp.), Congrio rosa (Genypterus sp.), Linguado (Paralichthys sp.), Sardinha (Sardinella sp.), Cação (Carcharhinus sp., Squalus sp., Squatina sp., Prionace glauca, Negaprion brevirostris, Galeocerdo curvier, Isogomphodon oxyrhynchus), Panga (Pangasianodon sp.) e Pescada (Cynoscion sp., Lonchurus lanceolatus, Macrodon ancylodon, Nebris micros, Odontoscion dentex, Isopisthus parvipinnis, Ophioscion audstus) de cada estabelecimento relacionado com a venda de pescado. Todas as amostras foram devidamente identificadas e separadas segundo o vendedor de cada estabelecimento.

O DNA das amostras foi extraído pelo kit DNeasy Blood and Tissue conforme orientação do fabricante e estocado a -20°C até o momento do uso. A amplificação pelo método de PCR do gene COI ocorreu de acordo com Ward et al. (2005), seguida de purificação dos produtos para sequenciamento pelo método de Sanger no equipamento 3500 (Life Technologies, Estados Unidos). As sequências foram editadas no programa BioEdit (Hall et al., 1999).

Os resultados foram analisados a partir do Blast (NCBI) para comparação de sequências do GenBank e pelo BOLD (Http://www.boldsystems.com). Após análise e alinhamento das sequências de referência, foram realizadas análises filogenéticas a partir de árvores geradas pelo programa MEGA 6.0, pelo método de máxima verossimilhança (MaximumLikelihood) e corrigidas pelo modelo de Hasegawa-Kishino-Yano com 1000 réplicas de Bootstrap (Tamura et al., 2013).

 

Tabela 1 – Tabela de identificação – Apresenta o número de amostras coletadas e os nomes populares que estes peixes recebem no mercado. As amostras foram marcadas com (*), os iniciadores utilizados no trabalho não amplificaram o DNA dessas amostras.

Fonte: Desenvolvido pelos integrantes do grupo.

 

Resultados

As amostras adquiridas no mercado de Belo Horizonte totalizaram dezesseis amostras de filés de peixes, sendo estas de dez espécies (Tabela 1). Das dezesseis amostras, somente doze tiveram o alvo de interesse amplificado e sequenciado. Possivelmente houve degradação do DNA das demais amostras, não obtendo sucesso na metodologia da técnica de extração de DNA (Amostras: 04,09,13 e 16). A amostra de filé de Pescada (06) não obteve sucesso no processo de sequenciamento.

Após o sequenciamento e edição, obtiveram-se doze sequências com a matriz contendo em média 640 bp. Com as sequências obtidas, foi realizado o alinhamento e análises junto aos bancos de dados NCBI (Blastn), GenBank e BOLD. Após análise, com o auxílio dos programas de bioinformática, BioEdit e MEGA 7.0, foram geradas árvores filogenéticas de agrupamento por máxima verossimilhança e corrigidas pelo modelo de Hasegawa-Kishino-Yano.

Na árvore obtida com as sequências referentes às amostras 01 e 11 (Figura 1), observou-se que estas se agruparam com o valor de bootstrap de 100% no ramo da espécie Salmo salar (Salmão). Portanto, como não há nenhuma distância genética que separe estas três sequências é possível afirmar que as amostras são pertencentes a exemplares de Salmo salar.

 

Figura 1 – Análise filogenética pelo método da máxima verossimilhança a partir de sequências obtidas no GenBank. As amostras 01 e 11 se agruparam no mesmo clado que as sequências de Salmo salar com alto grau de confiança.

Fonte: Desenvolvido pelos integrantes do grupo.

 

A árvore filogenética, gerada pelas análises das amostras 03 e 08 (Figura 2), demonstrou que estas ficaram agrupadas no ramo junto ao gênero Oreochromis com valor de bootstrap 100%; ainda assim, não é possível determinar ao certo a qual espécie pertencem as amostras, pois não há sinal filogenético que possibilite diferenciação além do gênero.

 

Figura 2 – Análise filogenética pelo método da máxima verossimilhança a partir de sequências obtidas no GenBank. As amostras 03 e 08 se agruparam no mesmo clado que as sequências de Oreochromis niloticus, O. aureus e O. mossambicus com alto grau de confiança.

Fonte: Desenvolvido pelos integrantes do grupo.

 

As amostras 05 e 14 foram agrupadas no mesmo ramo da árvore que a espécie Paralichthys patagonicus (Figura 3) com valor de bootstrap de 100%. Sendo assim, as respectivas amostras são da espécie P. patagonicus, confirmando com a espécie adquirida no mercado.

 

Figura 3 – Análise filogenética pelo método da máxima verossimilhança a partir de sequências obtidas no GenBank. As amostras 05 e 14 se agruparam no mesmo clado que as sequências de Paralichthys patagonicus com alto grau de confiança.

Fonte: Desenvolvido pelos integrantes do grupo.

 

A amostra 15 foi agrupada próximo ao ramo da árvore onde se encontra a espécie Sardinella janeiro (Figura 4), o valor de apoio deste agrupamento é de 87%. É possível observar que existe baixa distância filogenética entre S. janeiro e S. aurita, mas mesmo assim é possível visualizar que a amostra pertence à espécie S. janeiro, o que confirma o resultado do alinhamento em 87% de identidade.

 

Figura 4 – Análise filogenética pelo método da máxima verossimilhança a partir de sequências obtidas no GenBank. A amostra 15 se agrupou no mesmo clado que a sequência de Sardinella janeiro com alto grau de confiança.

Fonte: Desenvolvido pelos integrantes do grupo.

 

É possível visualizar, na árvore gerada com a sequência obtida da amostra 10, a formação de um clado monofilético do gênero Genypterus. Os valores de apoio para a separação das espécies desse gênero variam entre 70% e 100%, e o posicionamento específico da amostra tem o bootstrap de 91%, classificando-a como Genypterus brasiliensis (Figura 5).

 

Figura 5 – Análise filogenética pelo método da máxima verossimilhança a partir de sequências obtidas no GenBank. A amostra 10 se agrupou no mesmo clado que a sequência de Genypterus brasiliensis com alto grau de confiança.

Fonte: Desenvolvido pelos integrantes do grupo.

 

A árvore, gerada com as sequências 02 e 12, classificou as amostras para o gênero Merluccius (Figura 6). Não é possível determinar a espécie das amostras, pois no mesmo ramo ficaram alocadas duas espécies diferentes, M. hubbsi e M. productos. Este agrupamento é amparado por um bootstrap de 100%, porém em seu resultado de alinhamento, as amostras apresentaram 100% de identidade, 100% de Query cover e E-value 0.0 para a espécie M. hubbsi.

 

Figura 6 – Análise filogenética pelo método da máxima verossimilhança, a partir de sequências obtidas no GenBank. As amostras 02 e 12 se agruparam no mesmo clado que as sequências de Merluccius hubbsi e M. productos com alto grau de confiança.

Fonte: Desenvolvido pelos integrantes do grupo.

 

A amostra 07 ficou agrupada no ramo junto às espécies Pseudoplastystoma carruscans e Pseudoplastystoma fasciatum (Figura 7) amparada por um valor de bootstrap de 99%. Com isso é possível atribuir somente o gênero Pseudoplastystoma à amostra. Dentre as três sequências do ramo, não houve sinal filogenético suficiente capaz de distingui-las.

 

Figura 7 – Análise filogenética pelo método da máxima verossimilhança a partir de sequências obtidas no GenBank. A amostra 07 se agrupou no mesmo clado que a sequência de Pseudoplastystoma fasciatum com alto grau de confiança.

Fonte: Desenvolvido pelos integrantes do grupo.

 

Discussão

Em estudos envolvendo a técnica de Barcode, são observados resultados principalmente em casos de gêneros cuja taxonomia pode ser duvidosa (Pereira et.al, 2013). A metodologia de código de barras, no presente estudo, teve bastante eficácia para a discriminação dos gêneros e, em algumas amostras, para as espécies. Das doze amostras analisadas, em todas foi possível a determinação do gênero, e destas, apenas em seis foi possível determinar a espécie.

A PCR foi adaptada em diversos casos para melhor amplificação das amostras. Certas espécies não apresentaram resultados positivos no preparo do gel após o uso do protocolo descrito na publicação original, provavelmente devido a polimorfismos presentes na região de ligação dos iniciadores. Alterações de protocolo, como diminuição da temperatura de anelamento, permitiram amplificação.

Para as amostras positivas, após o sequenciamento e análise filogenética, os resultados apontaram que 100% dos gêneros determinados eram respectivos aos vendidos no mercado popular de Belo Horizonte, confirmando a não substituição das espécies. O resultado difere de outros trabalhos realizados na capital de Minas Gerais, onde taxas de até 80% de identificação incorreta de pescado foram encontradas (Carvalho et al., 2011).

Essa metodologia de identificação é de grande importância para a confirmação taxonômica de cada organismo morfologicamente parecido ou para aqueles que também não apresentam morfologia determinada, como no caso dos filés de peixes. Apesar de uma parte das espécies ter sido bem identificada, em outros casos, a região analisada não teve divergência suficiente para a identificação precisa além de gênero. O gênero Merluccius apresenta espécies crípticas que necessitam de outras metodologias ou fragmentos maiores para discriminação adequada à separação dentro do clado (Deli et al., 2015).

A identificação além do gênero pode não ser essencial em alguns casos quando o produto vendido não necessita corresponder a uma espécie, apenas como no caso da pescada e do surubim. No caso desse último, por exemplo, o vernáculo pode ser utilizado para P. corruscans e P. reticulatum (Froese and Pauly 2011). Em casos de espécies ameaçadas ou sob proibição, pode ser necessário o uso de novas estratégias ou aumento da região sequenciada. Firmat el al. (2013) utilizaram 423 loci de AFLP e genes mitocondriais para diferenciar espécies do gênero Oreochromis na tentativa de identificar híbridos e analisar espécies invasoras que ameaçavam a diversidades de grupos ameaçados de extinção.

Os resultados confirmaram a eficácia da metodologia aplicada mesmo não sendo possível a discriminação de 100% das espécies analisadas. A correta identificação precisa e inequívoca de quantidade de peixes, produtos de peixes, ovos para adultos têm importância em diversas áreas. A detecção de substituições de espécies ajuda a gerir as pescarias para uma sustentabilidade em longo prazo e melhora a pesquisa e a conservação dos ecossistemas (Ward, 2005).

 

REFERÊNCIAS

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Ward RD, Zemlak TS, Innes BH, Last PR, Hebert PDN. 2005. DNA barcoding Australia’s fish species. Philos Trans R Soc B 360:1847–1857.

 

NOTAS

[1] Graduando em Ciências Biológicas, Centro Universitário Newton Paiva. E-mail: adao93bh@hotmail.com

 

[2] Graduando em Ciências Biológicas, Centro Universitário Newton Paiva. E-mail: greicyguartinelli@hotmail.com

 

[3] Graduando em Ciências Biológicas, Centro Universitário Newton Paiva. E-mail: dani.veiga@live.com

 

[4] Coordenadora do curso de Ciências Biológicas e professora titular no Centro Universitário Newton Paiva. E-mail: livia.avelar@newtonpaiva.br

 

[5] Professor no Centro Universitário Newton Paiva, Fiscal Federal Agropecuário no Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais, LANAGRO/MG, Brasil. E-mail: antonio.biotec@gmail.com